Методы выделения ДНК

1. Методики выделения ДНК

Способы экстракции бывают разные, всего их семь и каждый из них имеет свои плюсы и минусы. Определяют следующие методы экстракции при помощи:

· силики (диоксид кремния);

· ионообменной смолы;

· бумажных фильтров;

· магнитных частиц;

· гель-фильтрации;

· органических растворителей;

· микроцентрофужной колонки.

Выбор одной из методик зависит от многих факторов и основывается исходя из определённых критериев:

· количества времени отведённого на анализ;

· поставленной задачи;

· ожидаемого результата (необходимой степени очистки, количества полученного образца и др.);

· первично выбранного материала для процедуры;

· дальнейшее применение полученной молекулы (ПЦР, синтез, клонирование).

1.1. Экстракция силикой

Пошаговое применение:

· к образцу добавляют гуанидинтиоцианат;

· все соединения денатурируют (связываются между собой), кроме ДНК;

· связывание молекулы с силикой;

· отмывка от других клеточных компонентов;

· превращение молекулы в раствор.

Метод практически не имеет недостатков, к ним относят лишь сложность получения молекулы из малого количества биологического образца. Преимуществ же значительно больше:

· экономичность;

· возможность автоматизации процесса;

· быстрота выполнения исследования;

· простой в исполнении;

· исключает наличие ингибиторов (замедление процесса).

1.2. Экстракция с использованием бумажных фильтров

Для исследования применяется специальная бумага (целлюлозный фильтр), она пропитана сильными буферами, они связывают нуклеиновые кислоты, денатурируя при этом белки. Кислоты защищены фильтром от ультрафиолета и нуклеаз. Этот способ показывает как положительные, так и отрицательные сторон.

Преимущества метода:

· безопасность в обращении с материалом;

· ДНК выделяется быстро;

· нуклеиновая кислота имеет высокое качество;

· полученный образец, может храниться длительное время при комнатной температуре;

· подходит для исследования практически любой жидкий материал;

· существует возможность автоматизации процесса.

Из недостатков определяют следующие:

· дороговизну способа;

· возможность применять лишь на жидких образцах;

· массу полученного ДНК невозможно скорректировать;

· может понадобиться изменения протокола.

1.3. Выделение при помощи магнитных частиц

Ещё один метод выделения молекулы, он заключается в том, что в исследуемый образец добавляются магнитные шарики и специальное лизирующие средство. Шарики связывают выделившуюся ДНК, а в процессе очищения происходит вымывание оставшихся клеточных элементов. Завершающим шагом становится элюирование молекулы низко солевым буфером.

Из недостатков можно говорить лишь о стоимости исследования, она сравнительно высока по отношению к другим методам. Из плюсов определяют:

· возможность выделять большое количество нуклидов за счёт большого объёма сорбента;

· в момент выделения минимизированы потери;

· малый риск перекрёстной контаминации, так как почти все нуклеиновые молекулы связываются сорбентом;

· масштабность методики;

· высокое качество продукта на выходе.

1.4. Выделение с применением гель-фильтрации

По определению, метод позволяет быстро разделить молекулы в соответствии с их размерами. Сам гель сформирован в виде гранул, расположенных поперечно, напоминая собою трёхмерную, молекулярную сетку или сито. В момент пропускания материала через колонку, наполненную этим гелием, происходит разделение веществ. После чего проводится очистка этилом или фенолом. Преимущество метода быстрота выполнения, из недостатков небольшое количество полученного материала.

1.5. Экстракция ионообменной смолой

В пробирку помещается исследуемый материал, к нему добавляется смола, после чего производят инкубацию в течение 30 минут, после кипячения и центрифугирование.

Плюсы процедуры:

· простота и быстрота исследования;

· дешевизна;

· возможность автоматизации;

· подходит практически для анализа любого материала.

К минусам относят:

· недостаточную очистку ДНК, она получается очень грубая;

· деградация молекулы через некоторое время;

· ингибирование процесса самими смолами;

· полученный образец не подходит для ПЦРФ.

2. Подготовка лаборатории к процессу выделения кислоты

Независимо, какой из методов будет использоваться, требуется тщательная подготовка рабочего места и лаборатории в целом. За час до начала исследования рабочую поверхность, штативы и прочее оборудование обеззараживают ультрафиолетом на протяжении 60 минут. По завершении работы дезинфекцию повторяют. Дополнительно, перед тем как приступить к процессу, столы обрабатывают 70% этиловым спиртом, полы также подвергаются дезинфекции специальными средствами. Всю необходимую пластиковую посуду (наконечники, пробирки, колбы) помещают на сутки в специальный контейнер, где она дезинфицируется 10% раствором хлорной извести и 5% хлорамина. А все сотрудники лаборатории обязаны быть в стерильной медицинской одежде, полностью закрывающей тело, а также тапочках, шапочках и резиновых перчатках. Все эти меры предпринимаются для того, чтоб не допустить загрязнение образца.

Как видно из описанного выше процесса, выделение ДНК, очень кропотливый труд, требующий стерильности, специального оборудования, серьёзной подготовки специалиста и, конечно, знаний. Для того чтоб получить поистине качественный образец следует придерживаться чёткой, пошаговой инструкции. Генетика — это не та наука, которая позволяет допустить оплошность, один неверный шаг и материал для исследования испорчен, а ДНК не получено, а ведь далеко не всегда у лаборанта есть возможность получения дополнительного образца.

Автор: Юлия Складаная